Biotin TUNEL细胞凋亡试剂盒产品说明书
Biotin TUNEL细胞凋亡试剂盒
产品货号：XK6068S
产品规格：20T, 50T
产品内容：
组分
规格 XK6068S（20T）XK6068S（50T）
A. Biotin TUNEL Reaction Buffer 1 mL 2 × 1.25 mL
B. TdT酶 20 μL 50 μL
C. Streptavidin-HRP 20 μL 50 μL
D. Streptavidin-HRP稀释液 1 mL 2×1.25 mL
E. DAB显色液A 100 μL 250 μL
F. DAB显色液B 1 mL 2×1.25 mL
G. DAB显色液C 50 μL 125 μL
H. Proteinase K (2 mg/mL) 40 μL 100 μL
I. DNase I (2 U/μL) 5 μL 13 μL
J. 10 × DNase I Buffer 100 μL 260 μL
储存条件
本产品应置于-20℃储存，组分 A、E、G 需避光，避
免反复冻融。有效期见外包装。注：组分 A、E、F、G 使
用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤，请立即用大量水冲洗。
产品介绍
细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解，
这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的 DNA 片
段约为 180 bp-200 bp 的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中
呈现特异的梯状 Ladder 图谱，本试剂盒采用 TUNEL 法，
应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 （Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase, TdT）在凋亡细胞断裂 DNA 的 3′-OH 末端催化
掺入生物素（Biotin）标记的 dUTP (Biotin-X-dUTP)。随后
和 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 标 记 的 Streptavidin
(Streptavidin-HRP)特异结合， 在 HRP 的催化下通过
DAB 显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜
观察并计数凋亡细胞。 由于正常的或正在增值的细胞几乎没
有 DNA 的断裂，因而没有 3′-OH 形成，很少能被染色。
TUNEL 法可以选择性的对凋亡细胞直接进行原位检测，而
非坏死细胞或因辐照和药物 而造成的DNA链断裂的细

胞，是一种更快速、直接的检测手段。

使用方法
实验材料（自备）
? PBS缓冲液（pH~7.4）
? 4%多聚甲醛（PBS配制）
? PBS配制 0.3% H2O2（新鲜配制）
? 70%乙醇（自选）
? 脱蜡溶剂（石蜡切片样本）2 / 3
US EVERBRIGHT
生物荧光试剂

本产品仅用于科研
实验步骤
1. 样本准备：
（1）细胞样品
a. 可选： 准备一份阴性对照样本 （加入不含TdT酶的TUNEL
反应液）。
b. PBS 清洗细胞两次。
c. 细胞固定：加入适量 4%多聚甲醛（pH 7.4）溶液，4℃放
置 30 min。
d. PBS 清洗细胞两次。
e. 通透细胞：细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100
溶液通透，室温放置 20 min。
f. PBS清洗细胞两次。
g. 封闭细胞： 每孔加入100 μL左右的配制于PBS中的0.3 %
H2O2溶液，轻敲孔板使其充分覆盖细胞，室温避光封闭 30
min，用 1×PBS 清洗细胞2 次；
（2）石蜡组织切片
a. 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2次， 每次 5 min，以
脱掉石蜡。
注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。
b. 室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2次，每次 5
min。
c. 室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇
（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗 1 次，每
次 5 min。
d. 室温下，将切片浸没于纯水中漂洗 3 min，再将切片浸没
于1×PBS中漂洗3 min， 用滤纸小心吸干切片样本周围液体。
e. 用免疫组化笔围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。
f. 按1: 100的比例， 将 2 mg/mL的蛋白酶 K 溶液用1 × PBS
稀释至终浓度 20 μg/mL，在每个样本上滴加 100 μL，使溶
液覆盖全部样本区域，室温孵育 20 min（蛋白酶 K 的孵育
时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。
注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，时间短达不到通透效果，
但延长孵育时间可能导致切片脱落。 一般情况下， 厚度 4 μm
孵育 10 min，厚度30 μm孵育 30 min。
g. PBS 浸润清洗切片两次，每次5 min。
h. 封闭：加入适量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液（新鲜
配制），室温孵育 30 min，以灭活切片内源的过氧化氢酶。
i. PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的
液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
（3）冰冻组织切片
a. 将冰冻切片放置于室温的片架上，室温 20 min，晾干。
b. 将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液中，室温固定 30 min。
c. PBS浸润清洗切片两次，每次 5 min。
d. 用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。
e. 按1:100的比例，将 2 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液用 1× PBS
稀释至终浓度 20 μg/mL。每个样本上滴加 100 μL，使溶液
覆盖全部样本区域，室温孵育 10 min（Proteinase K 的孵育
时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。
注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，时间短达不到通透效果，
但延长孵育时间可能导致切片脱落。 一般情况下， 厚度 4 μm
孵育 10 min，厚度 30 μm孵育 30 min。
f. PBS 浸润清洗切片两次，每次5 min。
g. 封闭：加入适量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液（新鲜
配制），室温孵育 30 min，以灭活切片内源的过氧化氢酶。
h. PBS清洗样品 3次，每次 5min，用滤纸吸去多余的液体，
将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
（4）阳性处理（仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进
行 TUNEL反应步骤）
a. 按 1:10 的比例用 diH2O 将 10× DNase I Buffer 稀释成 1 ×
DNase I Buffer 备用。
b. 滴加 100 μL 1× DNase I Buffer 到已通透的样本上，室温
平衡 5 min。
c. 用 1× DNase I Buffer 以 1:100 稀释 DNase I (2 U/μL)，使
其为终浓度 20 U/mL的工作液。
d. 轻轻吸掉多余液体， 加入 100 μL浓度为 20 U/mL DNase I
工作液，室温孵育 10 min。
e. 轻轻吸掉多余液体，PBS 清洗样品 2次。
2. TUNEL 反应
（1）配制TUNEL 反应液（即用即配）：3 / 3
US EVERBRIGHT
生物荧光试剂

本产品仅用于科研
1 个
样品
5个
样品
10个
样品
TdT酶 1 μL 5 μL 10 μL
Biotin TUNEL
Reaction Buffer
49 μL 245 μL 490 μL
TUNEL 反应
液总体积
50 μL 250 μL 500 μL
（2）每个样品加入 50 μL TUNEL 反应液，37℃避光孵育
60 min，组织样本需要 2 h（阴性对照样品加入不含 TdT酶
的 TUNEL反应液）。
注：50 μL Streptavidin-HRP 工作液适合涂片、切片或 96孔
板、48孔板、24孔板或 12孔板的一个孔，如果是 6孔板，
建议使用 100 μL。为防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸发，建
议在样品上覆上防蒸发膜。
（3）PBS清洗反应后的样品 3次，每次 5 min。
3. Streptavidin-HRP 工作液和 DAB 显色液的配制
（1）Streptavidin-HRP工作液的配制（即用即配）：
1个
样品
5个
样品
10个
样品
Streptavidin-HRP 1 μL 5 μL 10 μL
Streptavidin-HRP
稀释液
49 μL 245 μL 490 μL
Streptavidin-HRP
工作液总体积
50 μL 250 μL 500 μL
（2）DAB 显色液的配制（即用即配）：
1 个样品 5个样品 10个样品
DAB显色液A 5 μL 25 μL 50 μL
DAB显色液B 42.5 μL 212.5 μL 425 μL
DAB显色液C 2.5 μL 12.5 μL 25 μL
DAB 显色液总体积 50 μL 250 μL 500 μL
Biotin TUNEL细胞凋亡试剂盒