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    细胞复苏、传代与冻存的基本操作流程

    细胞复苏、传代与冻存操作流程
    一、仪器与试剂
     
    仪器 试剂 耗材
    离心机 胎牛血清(FBS 离心管(15ml50ml
    生物安全柜 无菌 1×PBS pH=7.2 T-25 细胞培养瓶
    电动移液器 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 一次性无菌移液管(2ml5ml10ml
    CO2 培养箱 完全培养基(含血清) 1.8mL 冻存管
    倒置显微镜

    液氮罐
    冻存液:90%FBS+10%DMSO

    异丙醇
    程序降温盒
    恒温水浴锅    
    超低温冰箱    
    护目镜厚毛线手套等

    二、操作流程:
    复苏
    1. 将恒温水浴锅中的水预热到 37℃;
    2. 准备一支 15ml 离心管,加入 5ml 10%FBS 的完全培养基,放入 37℃水浴锅中预热;
    3. 戴上护目镜,厚毛线手套后,从液氮罐中取出要复苏的细胞,尽快转入 37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率;
    4. 将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中,混匀后,1000rpm 离心 5min
    5. 准备一个 T-25 培养瓶,写上细胞名称、日期,再加入 4ml 完全培养基;
    6. 离心完成后弃去上清,用 1ml 完全培养基重悬细胞后,转入 T-25 细胞培养中,混匀后转入CO2 培养箱中培养静置。
    注意:从液氮中取出细胞冻存管时,若冻存管内有液氮进入,需拧松冻存管,排出内部残留
    的液氮,之后拧紧冻存管,置于干冰上,然后放入 37℃水浴中,避免温差太大造成液氮快速气
    化而爆炸。

    传代    (细胞传代建议一传二)
    1. 当细胞汇合度达到 85%以上时,可进行传代。
    2. 在生物安全柜内,打开培养瓶瓶口,收集瓶内的培养基;
    3. 向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS  后,水平放置培养瓶,使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上所有的面积,吸弃 PBS
    4. 向瓶内加入消化液 1ml,浸润底面后放入 37CO2 培养箱中孵育 1~2min
    5. 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起,若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2ml 10%FBS 的完全培养基中,将悬液吸入 15ml 离心管,
     
    注:如还有部分细胞未消化下来,可采用分步消化:
    准备一个无菌的 15ml 离心管,加入 2ml 10%FBS 的完全培养基;
    将消化下来的细胞吸入中的离心管内中和(避免吹打
    向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 2min 左右,轻拍培养瓶,95%左右细胞脱
    落后加入 2ml 10%FBS 的完全培养基中和,中和后的细胞悬液移入①中的离心管内
     
    1. 1000rpm 离心 5min
    2. 准备两个新的 T-25 培养瓶,各加入 4ml 完全培养基。
    3. 离心完成后,弃上清,用 2ml 完全培养基重悬离心细胞,将重悬后的细胞转入 2 T-25 养瓶,每个培养瓶各 1ml
    4. 水平放置培养瓶,震荡混匀后,将培养瓶置于 37℃,5%CO2 培养箱中静置培养。

    冻存  (细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支)

    1~6)参照传代步骤
    1. 离心完成后,弃上清,用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀,然后转入 1.8ml 冻存管中;
    2. 将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中,之后转入-80℃冰箱中过夜降温;
    3. 第二天,取出降温完成的序降温盒中的冻存管,尽快转入液氮罐中保存。